Altar mayor
El gran retablo protagoniza el espacio de la cabecera de la iglesia. Obra de Antonio de Segura, termina de instalarse en Yuste en 1584. Para ello fue necesario modificar el presbiterio y elevar, todavía más, su altura para dar mayor protagonismo a la nueva obra. En el ático aparecen las armas imperiales con el águila bicéfala explanada y el Toisón de Oro, símbolos de Carlos V. Las imágenes de los laterales representan las personificaciones de las virtudes: la Fe y la Esperanza, situadas a la derecha, y la Fortaleza y la Justicia, a la izquierda. La obra pictórica es conocida con varios nombres: El Juicio Final, La Gloria, Apoteosis de Carlos V o La Trinidad. El lienzo original de Tiziano fue encargado por Carlos V al pintor veneciano durante la segunda de sus estancias en Augsburgo (1550-1551), concluyéndose en 1554.
La obra llegaría a Yuste con el Emperador que la apreciaba hasta el punto de pedir que se la mostraran en los últimos instantes de su vida. El cuadro se conservó en Yuste hasta 1574, fecha en la que Felipe II decide trasladarlo a El Escorial, y encargará algo más tarde el retablo y la copia que hoy podemos contemplar. La obra representa el juicio particular a Carlos V y su familia en presencia de los profetas y de los personajes del Antiguo y Nuevo Testamento, como Moisés (sosteniendo las tablas de la ley), Noé (con el arca y la paloma entre sus manos), Ezequiel, David, San Juan Evangelista, la que se ha interpretado como alegoría de la lglesia (la mujer con ropaje verde de espaldas al espectador), etc. San Jerónimo, figura trascendental en el proceso contrarreformista, también aparece como anciano concentrado en las escrituras. En la zona superior central se sitúa la Trinidad y a la derecha aparecen retrasados Carlos V e lsabel de Portugal en actitud orange, Felipe II, la princesa Dña. Juana y posiblemente Dña. María de Hungría. El matrimonio aparece cubierto tan sólo con una sábana en señal de pobreza y con la corona imperial a los pies del Emperador en señal de renuncia a los bienes terrenales. En el banco del retablo aparecen representados, en pintura sobre tabla, los cuatro Padres de la lglesia, San Jerónimo y San Agustín a la izquierda y, San Ambrosio y San Gregorio a la derecha.